Importancia y proceso de purificación
¿Qué es la pureza peptídica?
La cantidad de péptido exacta en relación con todos los analitos se denomina pureza peptídica. El análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utiliza para evaluar la pureza de los péptidos, que suele examinarse a 214 nm. La pureza de los péptidos es un aspecto importante que influye en los resultados de un estudio de investigación. La síntesis química, los medios de cultivo o las técnicas de extracción y purificación son fuentes habituales de contaminación de los productos peptídicos.
¿Por qué es importante la pureza de los péptidos?
Los considerables avances en la disciplina científica de la síntesis peptídica han conducido a la producción masiva de péptidos personalizados. El desarrollo de tecnologías eficaces de purificación de péptidos ha cobrado cada vez más importancia a medida que se ha ampliado la fabricación de péptidos sintéticos con fines de investigación.
Los péptidos son moléculas complicadas, y su complejidad puede hacer ineficaces los procedimientos convencionales de purificación química orgánica. Debe prestarse la debida atención a lo largo de la síntesis para optimizar tanto la eficacia como el rendimiento, con el fin de suministrar a los consumidores el péptido más limpio posible al precio más asequible. Aunque los procedimientos de purificación basados en la cristalización suelen ser eficaces con otras sustancias, muchos procesos de purificación de péptidos utilizan principios cromatográficos, como la cromatografía de fase inversa.
¿Cómo se determina la pureza de los péptidos?
La pureza de los péptidos puede determinarse mediante HPLC y espectrometría de masas (EM). La HPLC es un proceso científico para separar, identificar y cuantificar cada componente de la mezcla. Es un método mejor que permite el análisis exacto de los péptidos. Al mismo tiempo, la espectrometría de masas es un método para medir masas dentro de una muestra mediante la ionización de entidades químicas y la clasificación de los iones en función de su relación masa-carga. Los resultados se representan como un factor de la relación masa-carga utilizando la señal de iones. Ambos procedimientos son metodologías de ensayo de péptidos muy fiables que demuestran la pureza y la identificación de los péptidos en cuestión.
Proceso de purificación de péptidos
Por lo general, el proceso de purificación debe ser lo más sencillo posible, obteniendo la pureza deseada, y el proceso no debe ser largo. Dos o más métodos de purificación realizados secuencialmente pueden producir resultados extraordinarios, especialmente cuando cada paso emplea principios cromatográficos diferentes. Por ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico combinada con la cromatografía en fase inversa puede dar lugar a un producto final extremadamente puro.
El paso inicial en la purificación de péptidos suele ser una fase de captura, que elimina la mayor parte de los contaminantes de la mezcla de péptidos sintetizados. Varios contaminantes eliminados durante esta fase se crean durante la etapa final de desprotección de la síntesis peptídica y suelen ser neutros, es decir, sin carga, y de bajo peso molecular. Aunque esta etapa inicial puede eliminar una proporción sustancial de contaminantes, se puede realizar una segunda etapa de purificación si se desea un mayor nivel de pureza. Este segundo proceso, que es el pulido, tiene mucho éxito, sobre todo cuando se utiliza junto con el enfoque cromatográfico indicado anteriormente.
Niveles de pureza de los péptidos
La calidad de las preparaciones de péptidos producidas para la investigación por otros proveedores puede variar enormemente. En general, cuanto mayor sea el nivel de pureza del péptido, mejor será la preparación; sin embargo, para algunos fines (como la investigación in vitro o los ensayos clínicos), sólo serán adecuados los péptidos extremadamente puros. Por otra parte, para algunos fines, puede ser suficiente una menor pureza del péptido. En consecuencia, el nivel mínimo de pureza del péptido para una aplicación específica variará en función de su finalidad. A continuación se ofrecen algunos ejemplos de niveles mínimos de pureza admisibles.
Pureza superior al 95% (alta pureza)
- Ensayos clínicos
- Investigación in vitro e in vivo
- Estudios farmacéuticos
- Cristalografía
- Péptidos cosméticos
- Síntesis de anticuerpos monoclonales
- Experimentos cuantitativos de bloqueo e inhibición competitiva
- Investigación cuantitativa de la interacción receptor-ligando
- Protocolo estándar cuantitativo ELISA y RIA
Pureza del 86% al 95% (Pureza media)
- Estudios de bloqueo peptídico
- Estudios de fosforilación
- Investigación sobre la adhesión celular
- Investigación RMN
- Estudios de fosforilación
- Experimentos de mapeo de epítopos
- Investigaciones semicuantitativas de las interacciones enzima-sustrato
Pureza del 70% al 85% (nivel inferior de pureza)
- Normas ELISA para evaluar los títulos de anticuerpos
- Matrices de péptidos
- Antígenos para la generación de anticuerpos policlonales o la purificación por afinidad
